La toxina botulínica: aspectos moleculares, formulación y farmacodinamia

Introducción

La toxina botulínica (TB) fue identificada con la elucidación de la etiología del botulismo alimentario, que es una forma de intoxicación debida a la presencia de una toxina que se genera en los alimentos contaminados por la bacteria Clostridium botulinum.

El término “botulismo” se refiere a la intoxicación alimentaria por ingestión de salchichas o embutidos (botulus), descrita por Kerner en 1817¹. La bacteria responsable del botulismo se denominó inicialmente Bacillus botulinus², y más tarde C. botulinum. Los términos “toxina botulínica” (toxina procedente de C. botulinum) y toxina botúlica (procedente de botulus) son sinónimos y se utilizan indistintamente. En 1946, la TB de tipo A se aisló en forma pura³. Su denominación de “toxina cristalina” hacía pensar que se trataba de una entidad simple. Veinte años después, se descubrió que estaba compuesta de varias proteínas asociadas en un complejo estable, conteniendo una entidad neuroactiva (la neurotoxina botulínica) y varios tipos de proteínas no tóxicas⁴. Por esto la toxina (complejo toxínico) se ha denominado toxina progenitora o protoxina en la literatura anglosajona^5‑11.

Neurotoxinas botulínicas

Se han identificado 7 serotipos de TB (A ‑ G) según su antigenicidad diferente. Todos son producidos por bacterias anaerobias del tipo Clostridium, incluido C. botulinum y otras Clostridiae. Así, la toxina de tipo E la producen C. botulinum y determinadas cepas de C. butyricum, la toxina de tipo F la produce C. botulinum y determinadas cepas de C. barattii, y la toxina G la produce solamente C. argentinense^11,12.

Se ha identificado un único tipo de entidad neuroactiva para los 7 tipos de toxinas: la neurotoxina botulínica (BoNT), que tiene sendos toxinotipos diferentes (A ‑ G). La neurotoxina se sintetiza bajo la forma de un precursor monocatenario de unos 1.300 aminoácidos (de unos 150 kDa) que no está activo. La separación proteolítica entre el puente disulfuro (S‑S), y el N‑terminal del precursor lo convierte en una proteína plenamente activa, neurotoxina propiamente dicha, que comprende una cadena ligera (L, unos 50 kDa) unida a través de un puente S‑S a una cadena pesada (H, unos 100 kDa) (Figura 1).

La secuencia de aminoácidos de las neurotoxinas botulínicas se estableció hace una veintena de años^13,14. La comparación de las secuencias establecidas ha revelado que cada toxinotipo de neurotoxina corresponde de hecho a una familia de variantes o “subtipos”. Por ejemplo, la neurotoxina de tipo A se reparte en al menos 5 subtipos principales (A1 a A5). Cabe destacar que una parte de las mutaciones que distinguen los diferentes subtipos afecta considerablemente a la región de la cadena ligera que está implicada en el reconocimiento del núcleo intraneuronal, y a la cadena pesada, que está implicada en los enlaces neuronales. Estas modificaciones son bastante importantes para causar la formación de anticuerpos específicos de un determinado subtipo y conferir a los subtipos propiedades funcionales diferentes^15‑17. Esto se traduce en diferentes tipos de eficacia, aumentadas o reducidas, y que podrán variar en un factor superior a 10¹⁸.

La estructura tridimensional de varios tipos de neurotoxinas botulínicas ya ha sido resuelta y muestra una organización modular en 4 partes diferentes: la cadena ligera es globular con un valle que contiene un sitio enzimático y un átomo de zinc; la cadena pesada comprende una extensión N‑terminal que rodea la cadena ligera y, una especie de “belt loop” bloquea el acceso al sitio catalítico cuando el puente S‑S que une las 2 cadenas no se reduce. En la parte C‑terminal, la cadena pesada posee unas largas hélices Alpha implicadas en la penetración de las membranas y, por último, su mitad C‑terminal presenta un conjunto de hojas beta organizadas en 2 subdominios. Están implicados en el enlace de la neurotoxina y sus receptores^19‑22.

Complejos o toxinas botulínicas

Las proteínas no tóxicas asociadas a la neurotoxina comprenden, por un lado, una proteína sin actividad, y por otro, 3 proteínas hemaglutinantes (proteínas HA). Las proteínas NHNH y HA carecen de actividad neuroactiva y no contribuyen por tanto al beneficio terapéutico de la inyección de TB^10,23. En cambio, estas proteínas desempeñan un papel muy importante en el botulismo infantil o alimentario. La toxina se mantiene estable en pH ácido, y las proteínas asociadas protegen a la neurotoxina contra el ataque ácido y las proteasas digestivas^24,25. Además, ciertas proteínas HA actúan sobre las uniones intercelulares formadas entre las células epiteliales del intestino, favoreciendo que la neurotoxina atraviese la barrera intestinal^26,27. Las proteínas HA de la TB de serotipo C tienen una acción citotóxica sobre las células MDCK (Madin-Darby Canine Kidney), una línea de células epiteliales renales, lo que crea dudas sobre su acción sobre otros tipos celulares²⁷.

Se pueden conseguir varios complejos toxínicos (o toxinas) a través de la asociación de proteínas HA y NTNH con la neurotoxina. Los tres tamaños de complejo más frecuentes tienen una masa molar aproximada de 300 kDa (complejo S, que contiene sólo 1 neurotoxina asociada a 1 NTNH); complejos L (unos 500 kDa) y LL (sobre los 900 kDa) que corresponden a 2 formas muy frecuentes de complejo, con una molécula de neurotoxina, una de NTNH y proteínas HA de número variable²⁸ (Figura 2).

Las proporciones relativas de las diferentes proteínas en un complejo aún no han sido bien determinadas. En cuanto a los complejos de tamaño intermedio (complejo L, de 500 kDa), el de la toxina D ha sido estudiado en el microscopio electrónico, y ha revelado que las proteínas asociadas no forman un escudo protector alrededor de la neurotoxina²⁹. La determinación de la estequiometría de los diferentes componentes del complejo LL de 900 kDa de la toxina tipo A muestra una sola molécula de neurotoxina por complejo³⁰. Esto refuta la propuesta inicial de que el complejo LL fuera un dímero del complejo L³¹.

Para ciertos subtipos de toxina, aparte de la proteína NTNH, que está altamente conservada, las proteínas asociadas a la neurotoxina pueden diferir enormemente de las proteínas HA de las cepas de referencia A1 o B1^15,16,32. Los complejos correspondientes son por tanto muy diferentes de los producidos por las cepas Hall A y adyacentes (sub‑tipo A1), a no ser que las cepas B1 de referencia y sus propiedades aún no hayan sido caracterizadas correctamente.

TB en la práctica clínica

De los 7 serotipos principales de TB, solo los tipos A y B tienen una aplicación terapéutica efectiva. No obstante, se han llevado a cabo ensayos con los tipos C y F. Existen varias formulaciones basadas en la toxina (complejo) o en la neurotoxina botulínica; algunas han sido aprobadas por las autoridades sanitarias de la UE y otras no. La Tabla I muestra algunos ejemplos. En la comercialización en distintas zonas del mundo, una misma formulación puede tener varias denominaciones (por ejemplo, Vistabel® y Botox-Cosmetic®). Todas las formulaciones de toxina/neurotoxina de tipo A que tienen una autorización de comercialización dentro del mercado europeo, tanto en campos asociados a neurología, medicina de rehabilitación, oftalmología, como las aplicaciones en estética, son producidas por cepas muy parecidas a la cepa Hall de C. botulinum (Botox®) y producen una neurotoxina de subtipo 1^33‑35. De manera errónea, la cepa NCTC 2916 bivalente A2/B1 se menciona en la literatura relativa a Dysport®. Los productos derivados de estas toxinas (Vistabel®, derivado de Botox®, Azzalure®, derivado de Dysport® y Bocouture®, derivado de Xeomin®) provienen también del mismo subtipo A1. La única formulación de toxina de tipo B (Myobloc®/Neurobloc®) se basa en una toxina producida por la cepa Bean de C. botulinum, que es probablemente del subtipo B1. Desafortunadamente, la identidad de las cepas productoras de toxina y, por tanto, la identidad de los correspondientes subtipos en cientos de formulaciones disponibles en el mercado internacional aún no está claramente establecida en la literatura.

La mayoría de las formulaciones disponibles están compuestas de toxinas (complejos) y excipientes. Varios de los productos más recientes están basados en la neurotoxina purificada. Los complejos toxínicos utilizados pueden diferir en tamaño o en sus proteínas accesorias. El tamaño diferente de los complejos viene indicado por un peso molecular diferente. Según las indicaciones de Allergan, sólo el complejo ~900 kDa estaría presente en el Botox®, Botox-Cosmetic®, Vistabel®³¹. Por omisión, se sugiere que Dysport® y Azzalure® son una mezcla de complejos L y LL (complejos de 600 a 900 kDA)³⁵.

Myobloc®/Neurobloc® tendrían únicamente la forma de complejos L de tamaño intermedio, pues nunca se ha empleado la fórmula con 900 KDa para el tipo B. La neurotoxina obtenida por purificación y homogeneidad, tras la disociación de la toxina (complejo), es la base de Xeomin® y Bocouture®³⁶.

Todas las formulaciones de TB disponibles tienen la presencia de excipientes que pueden diferir de un producto a otro. La presencia de albúmina sérica humana tiene el objetivo de minimizar la adsorción no específica de la toxina o de la neurotoxina en la superficie de jeringas y frascos. Su inyección se tolera perfectamente. La cantidad de albúmina sérica humana varía según las formulaciones, y a veces según las formulaciones derivadas (por ejemplo, 500 unidades de Dysport® y 125 unidades de Azzalure® difieren en una relación de 1 a 4 por la cantidad de toxina A, pero contienen la misma cantidad de albúmina. El uso de gelatina animal en ciertos productos, utilizados fuera de la UE, despierta dudas sobre su inocuidad.

Desde hace varios años, se ha observado una diversidad creciente de nombres en los productos distribuidos, aunque a veces están basados en la misma toxina. Además, la medida de la actividad de cada formulación se indica con sistemas de unidades que no son equivalentes. Con vistas a introducir la noción de no-intercambiabilidad de los productos, y para minimizar los riesgos de errores, la FDA (USAN Council) ha introducido en Estados Unidos una nomenclatura técnica independiente de los nombres de marca (Tabla II).

Disociación de la TB y pH del medio

Para que la actividad de la TB se pueda manifestar, ha de disociarse para liberar la neurotoxina. La toxina es estable en pH ácido. Con respecto al tipo A1 (es decir, del subtipo Botox®, Dysport® y formulaciones derivadas Vistabel®; Azzalure®, y la toxina progenitora de Xeomin®), en condiciones de fuerza iónica y de pH del plasma (~7,4), o para un pH ~7,0, la disociación de la toxina es total y rápida en aproximadamente un minuto^37,38. Por un lado, se libera la neurotoxina y por otro las proteínas asociadas. Por lo tanto, inyectar la toxina (complejo) o la neurotoxina purificada supondría lo mismo en términos de biodisponibilidad de la neurotoxina.

El pH del medio de inyección en el que se reconstituye la toxina es de vital importancia;  en un medio con pH neutro o superior inducirá probablemente a la disociación de la toxina en el envase antes de la inyección. Este es posiblemente el caso de las formulaciones de toxina de tipo A reconstituidas en pH neutro tales como Botox® (toxina A, albúmina humana y NaCl 0,9%), Dysport® (toxina A, albúmina humana y lactosa) y sus respectivas formaciones derivadas (Vistabel®, Azzalure®). La única formulación de toxina de tipo B que tiene una AMM (permiso de comercialización de un medicamento) en Francia (Myoblock®: toxina B, succinato de sodio, NaCl, albúmina humana) se reconstituye en un medio con pH=5,6. ¿Qué ocurre entonces con su rapidez de disociación tras la inyección intramuscular, teniendo en cuenta que el pH intramuscular está generalmente entre 6,1 y 7? Estas cuestiones sobre la naturaleza y la composición del complejo toxínico, así como las posibles actividades de las proteínas asociadas no se plantean en el caso de Xeomin®/Bocouture® (neurotoxina A, albúmina humana y sacarosa) puesto que se trata de una neurotoxina purificada, sin ninguna proteína del complejo botulínico.

Medición de la actividad biológica de la toxina

El proceso de purificación de la toxina/neurotoxina da lugar a un producto muy puro pero que contiene tanto proteínas activas como proteínas inactivas. Llegada la hora de la inyección terapéutica, es más importante inyectar una “cantidad de actividad” garantizada que una cantidad ponderal bien definida. Por ello, las cantidades de toxina a inyectar se definen por medio de un sistema de unidades que hacen referencia a la actividad biológica de la toxina³⁹. Desde el punto de vista de las aplicaciones terapéuticas de las toxinas, hay pocos modelos pertinentes. De manera general, se pueden tener en cuenta los test de letalidad, de funcionalidad y de actividad molecular. La prueba de letalidad en ratones (mouse LD 50 assay) es el más utilizado y permite determinar la dosis media letal de toxina/neurotoxina inyectada intraperitonealmente; lo que provoca en ratones de cierto peso la muerte por asfixia, constatada tras un intervalo de tiempo determinado, por ejemplo 72 o 96 horas.

También existen pruebas funcionales para medir la actividad de la toxina. Por ejemplo, midiendo la parálisis local in vivo (fuerza de agarre de la mano, grip test), la parálisis ex vivo (contracción del hemidiafragma o de un músculo intercostal), el potencial de acción compuesto de determinados músculos. Los test de actividad molecular están basados en la dosificación de la actividad enzimática de la toxina para con su substrato. No obstante, este último no permite evaluar la internalización de las neurotoxinas en su objetivo neuronal.

La reproductibilidad del test de letalidad anda lejos de ser perfecta debido a un fuerte efecto “operador”⁴⁰. Sin embargo, es la prueba más utilizada por todas las industrias para medir la actividad biológica de los preparados comerciales de toxina/neurotoxina. Una unidad de toxina se define como 1 LD 50, esto es, la dosis de toxina/neurotoxina capaz de matar 1 de cada 2 ratones inyectados.

Unidades de los productos comerciales

Las condiciones de realización de los test de letalidad son diferentes de una empresa a otra, con la consecuencia de determinar una actividad biológica diferente para una misma cantidad ponderal de toxina/neurotoxina. La prueba mouse LD 50 assay debería realizarse minimizando al máximo la adsorción no específica de la toxina en la superficie de los envases y jeringas, mediante la adición de proteínas (albúmina sérica o gelatina)^34,41. Esta prueba fue utilizada primero por Speywood Pharmaceuticals Ltd. y después por IPSEN; se procede mediante la disolución de la formulación comercial de toxina en un tampón con gelatina al 0,2%, mientras que el protocolo que sigue Allergan diluye la formulación en una solución salina sin añadir ninguna proteína^42,43.

La gelatina suele ser una mezcla heterogénea de péptidos cuyo peso molecular puede variar por encima de un factor 10. Así, el 0,2% de gelatina del protocolo Speywood corresponde a concentraciones del orden de ~0,1 a 1 mM final, lo cual es muy superior a las concentraciones micromolares que se consiguen mediante la albúmina sérica humana de las formulaciones comerciales. A concentraciones tan pobres, no hay suficiente albúmina sérica para bloquear la absorción no específica³⁴. En consecuencia, el protocolo de Allergan para la prueba mouse LD 50 assay sólo moviliza una fracción de la toxina contenida inicialmente en el envase. Este protocolo proporciona por tanto una evaluación de la actividad biológica que se inyecta bajo las condiciones de la práctica clínica. El test Speywood sigue las buenas prácticas de la farmacología europea y se realiza en condiciones que permiten movilizar lo esencial de la toxina contenida en el envase; de esta forma se evalúa la cantidad de actividad de la toxina contenida en este.

Estas diferencias en los protocolos de evaluación de la actividad biológica de las toxinas hacen que una misma cantidad ponderal de toxina activa se asocie a un número de unidades diferente según la empresa, y que las unidades Allergan difieran de las unidades Speywood (IPSEN). Esta noción puede generalizarse para todas las toxinas.

La utilización de sistemas de unidades diferentes impide la intercambiabilidad de los productos en ausencia de un sistema de conversión. De manera interesante, Hambleton y Pickett (1994) demostraron que 100 U‑Botox que pasaron el test Speywood obtuvieron una evaluación de 270‑360 U‑Speywood (un factor de diferencia de 2,7 a 3,6) y que 500 U‑Speywood tratadas con el test Allergan obtuvieron 267 unidades Allergan (factor de 2,4)⁴³. Estas diferencias de un factor 2,5 a 3 se corresponden con el factor de conversión determinado empíricamente por los facultativos. Varios estudios indican que, si se reformularan las toxinas comerciales en medios enriquecidos con albúmina, con la misma concentración, estas toxinas de las diferentes empresas producirían efectos idénticos tanto in vitro como en ensayos con voluntarios sanos^34,44.

Difusión de la TB

En caso de botulismo, la neurotoxina circulante puede detectarse durante varios días e incluso más de una semana después del final de la intoxicación¹¹. Podría deberse a un efecto de depósito en el sistema linfático, o a las grandes cantidades de TB ingeridas o producidas en el intestino. En clínica, la aplicación de la TB o la neurotoxina es puntual y en cantidades limitadas. Sin embargo, como los músculos están fuertemente irrigados, con una importante red de capilares sanguíneos alrededor de las fibras musculares, la inyección produce mecánicamente una fractura que conduce obligatoriamente a la diseminación hematógena de la neurotoxina a través de dicha red. Esto permite la difusión de la neurotoxina en los tejidos, con lo que llega hasta terminaciones nerviosas distantes de los sitios de inyección en el músculo inyectado, pero también es fuente de efectos no deseados⁴⁵. La gravedad de los efectos dependerá de la concentración de neurotoxina obtenida a distancia del sitio de inyección. Allá donde se alcancen las concentraciones más fuertes, se producirá una forma de botulismo iatrógeno localizado, que cursa con una parálisis muscular limitada a los músculos adyacentes a los sitios de inyección o una acción sobre las glándulas vecinas. La difusión del efecto de la toxina a los músculos vecinos, de acción antagonista, puede tener otra causa, implicando las vías reflejas⁴⁶. Las débiles concentraciones circulantes de neurotoxinas pueden provocar una disautonomía sistémica.

La cantidad de neurotoxina diseminada depende de la concentración utilizada, del volumen inyectado y de las lesiones tisulares locales debidas a la fractura de tejidos por culpa de la aguja de inyección o la disección de tejidos por el volumen de solución inyectado. La cuestión del impacto sobre la difusión/diseminación de la composición (toxina versus neurotoxina, tamaño de los complejos, presencia de otras proteínas…) de las diferentes formulaciones ha sido objeto de diversos estudios^44,47,48. Ya se ha mencionado que con pH plasmático (pH=7,4), la TB se disocia rápidamente y libera la neurotoxina. Esto explica por qué no hay diferencia significativa entre los diferentes preparados comerciales de neurotoxina (Xeomin®) y de toxina (Botox®), ni en términos de difusión ni diseminación entre la toxina A y la neurotoxina A marcadas con yodo‑125⁴⁹, ni en términos de difusión de los efectos paralizantes a los músculos adyacentes⁴⁴. No obstante, existe un debate contradictorio que se alimenta de la observación de las diferencias en la “difusión de los efectos de la toxina” (es el caso de ciertos estudios que comparan Botox® y Dysport®), ambas formulaciones basadas en un complejo botulínico de tipo A1. Teniendo en cuenta que los complejos de tipo A1 se disocian muy rápidamente a pH fisiológico, y que la entidad que se difunde es la neurotoxina, las diferencias registradas no pueden explicarse en términos de propiedades intrínsecas de difusión que sean diferentes. Una hipótesis explicativa sería que las cantidades de TB utilizadas en los estudios comparativos eran diferentes por el problema de inyección de dosis de toxina idénticas (volumen y concentración idénticas) mientras que la actividad biológica de las formulaciones se explicaría en los sistemas de unidades diferentes.

Duración de la vida sistémica de la neurotoxina botulínica

Dejando a un lado la pequeña fracción de neurotoxina que las terminaciones de las motoneuronas capturan, la parte esencial de la neurotoxina libre desaparece del sitio de inyección por su disolución en el sistema circulatorio: en las ratas, 30 minutos después de la inyección en el músculo gastrocnemio, un 70% de la neurotoxina inyectada se puede detectar en el sitio de la inyección. Tras 6 horas, sólo queda el 30% y después de 24 horas sólo el 5%⁴⁹. En el compartimento sanguíneo, la neurotoxina tiene un tiempo de semivida del orden de 10 horas, ya que se elimina rápidamente, sobre todo por el hígado y el bazo^50,51. Estos datos sugieren que el intervalo de tiempo entre dos inyecciones de toxina o de neurotoxina podría reducirse fuertemente sin riesgo de efecto acumulativo de las dosis inyectadas.

Dosis letal de TB en el hombre

Teniendo en cuenta que la inyección de TB con fines terapéuticos puede generar una forma de botulismo iatrógeno, es conveniente examinar cuáles serían las dosis peligrosas en el caso de que la totalidad de la toxina inyectada sufriera una diseminación sistémica. En los mamíferos, la dosis letal de TB (complejo de 900 kDa) de tipo A es del orden de 1 ng/kg, con variaciones notables: 1,2 ng/kg en los ratones; 0,5‑0,7 ng/kg en la cobaya, el conejo o el mono⁵². Por extrapolación, la dosis letal en el hombre sería de 90‑150 ng de toxina de tipo A (complejo) inyectada intravenosa o intramuscular^53,54. Extrapolando las experiencias con monos, y sobre la base de 1 U = 1 DL₅₀ ratón Scott y Suzuki (1988) sugieren que la dosis más débil que puede producir botulismo sistémico (con distrés respiratorio) en el hombre es del orden de 33 U/kg, y la DL₅₀ en el hombre es de 38‑42 U/kg (~2.800 U para un sujeto adulto de 70 kg)⁵⁵. Resulta muy superior a la dosis máxima sugerida en las fichas RCP de los productos con toxinas comercializados por diferentes compañías farmacéuticas.

Conclusiones

Los preparados comerciales aprobados en nuestro país han sido valorados en distintos medios, lo que dificulta la correcta equivalencia entre las TB comercializadas, como se ha indicado en este trabajo. Tal como se indica en cada ficha técnica no todas sirven para inyectar en los mismos grupos musculares. Esto hace imprescindible que el médico conozca a fondo las toxinas comercializadas y se familiarice con los conceptos expresados a fin de obtener resultados clínicos equiparables en caso de manejar diferentes toxinas.

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Nota del editor

Con relación al presente artículo debe tenerse presente el tiempo transcurrido, por lo que se incorporan nuevas referencias destinadas a actualizar los conocimientos sobre las las diferentes toxinas botulínicas presentes en nuestro país.

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